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    染色體結構顯示和檢測方法

    放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-08

    一、染色體顯帶

    顯Q帶法

    1.漂洗:取經過干熱預處理或已老化的染色體標本,置于pH6.0緩沖液中浸5~10分鐘。
    2.染色:浸入pH6.0的GM或QD染液中5~10分鐘。
    3.漂洗:浸入新鮮pH6.0緩沖液中漂洗兩次,每次5分鐘。
    4.觀察:向標本染色體面滴1~2滴新鮮緩沖液,覆以蓋片(避免出氣泡),置熒光顯微鏡下觀察。


    顯G帶法

    胰酶-Giemsa混合顯帶法

    1.預處理:取中期染色體標本,置60℃~60℃溫箱中20~30分鐘,或在37℃溫箱過夜,然后浸入0.025M磷酸緩沖液中,pH6.8,56℃溫浴10分鐘。
    2.消化和染色:用現配制的胰蛋白酶-Giemsa混合液消化和染色10~30分鐘,混合液按如下比例配制:
    0.025 M 磷酸緩沖液pH6.8 73.0 ml
    甲醇 27.0 ml
    Giemsa干粉 50.0 mg
    0.25%胰酶 0.3~0.4 ml
    3.封片:染色后用自來水沖洗,入蒸餾水漂洗數次、晾干、二甲苯透明2~3分鐘,封入中性樹脂中。

    Giemsa顯帶法
    1.預處理:將標本置入60~80℃溫箱或烤箱中20~30分鐘,亦可在37℃溫箱過夜。
    2.胰酶消化:用0.85%的NaCl配制0.25%胰蛋白酶溶液消化3~5分鐘。
    3.染色:取出標本片,先直立于吸水紙上除去多余胰酶液后,隨即置入Giemsa染液中,染10分鐘。
    4.封片:自來水洗,蒸餾水漂洗,晾干,二甲苯透明2~3分鐘,封入中性樹膠中。

    二、姐妹染色單體分化染色

    BUdR摻入和制片程序

    1.BUdR培養液制備:先制備好含BUdR的培養液(最終濃度為3~10微克/毫升)。
    2.BUdR摻入:如用傳代細胞,在末次傳代后,改換用含BUdR的培養液培養。如為人末梢血細胞,一開始就用含BUdR培養液培養(培養瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑紙包裹)37℃溫箱內培養。
    3.中止摻入與制片:待細胞經歷兩個細胞周期(人周圍血細胞培養48或72小時)
    4.加秋水仙素—制片。

    姐妹染色單體分化染色

    方法一
    1.老化:中期染色體標本老化1~2天。
    2.預處理:放入預熱至85~89℃的1 M NaH2PO4處理15分鐘。
    3.制片:然后用溫蒸餾水輕輕漂洗,蒸餾水沖洗,晾干,Giemsa液染色10分鐘,晾干,二甲苯透明,封固。

    方法二:即FPG法
    1.標本:摻入BUdR后的中期染色體標本。
    2.熒光染色:用熒光染料Hoechst 33258(用pH7.0 Sorensen緩沖液配制,濃度為0.5微克/毫升)染色12~15分鐘。
    3.黑光燈照射:自來水沖洗,加1滴pH8.0 緩沖液,覆以蓋片,用黑光燈照射(20 W),距離5厘米,時間半小時。
    4.溫浴:50~60℃熱的2×SSC液溫育2小時,蒸餾水沖洗,晾干。
    5.染色:pH6.8的2%Giemsa染色15分鐘,透明封固。

    方法三
    1.標本:摻入BUdR后的中期染色體標本,置30瓦日光燈下,燈距3厘米,照射6小時。
    2.溫浴:用2×SSC液(60℃)處理15分鐘。
    3.Giemsa染色10分鐘,也可獲得滿意的標本。

    三、染色體脆性位點的檢測
    為提高檢出率,可采取以下措施:
    1.在培養時把血清量降到5%。
    2.用不含葉酸的MEM-Fra培養基培養。
    3.PH調至7.5。

    四、微核檢測

    方法一:
    1.采血:靜脈采血0.5ml,肝素抗凝,用小方瓶培養,加培養液5ml。培養液租成為:含20%小牛血清的Eagle液,加PHA 40微克/毫升。
    2.培養:置37℃溫箱內培養48或72小時,以1000rpm離心8分鐘。
    3.固定:3:1甲醇/冰醋酸固定3次,每次15分鐘,離心沉淀固定液。
    4.制片:冷凍載片滴片法制片,自然干燥,10%Giemsa(pH6.8)染色15分鐘。


    方法二
    1.采血:肝素抗凝血0.5~0.6ml,置10ml試管中,加入血量一半的0.5%甲基纖維素,充分混合。
    2.培養:置37℃溫箱中靜置培養30分鐘,以2000rpm離心10分鐘,去上清液。
    3.制片:做涂片,Wright法染色。

    方法三
    1.采血:用三棱針刺無名指取血0.6ml,立即注入內徑3mm,長5cm的血液沉淀管中,用小玻璃棒攪拌除去纖維蛋白。
    2.加明膠:加入3%的明膠,小心混勻,置37℃溫箱自然沉降50分鐘。
    3.吸去上清液,離心,沉淀物涂片,自然干燥,Wright染色30分鐘,再用Giemsa染色2分鐘。

    五、非程序DNA合成檢測(UDS)
    放射自顯影UDS的測定:
    1.細胞培養:WI-38成纖維細胞,完全培養液支持物蓋片培養法培養,細胞生長至匯合時。
    2.抑制DNA合成:棄舊培養液,加入不含精氨酸的EMEM培養液,繼續培養20~24小時。
    3.加測試物:加入10mM羥基脲(陽性對照加MNNG),培養2小時。
    4.H-TdR處理:2、3、4每皿內加3H-TdR后,培養20~24小時。
    5.漂洗:去除培養液,用不含鈣、鎂BSS漂洗。
    6.制片:制備放射自顯影標本方法固定細胞、涂膠、曝光、顯影及染色。
    7.觀察:在油鏡下計數,首先要排除S期半保留復制細胞(為銀粒覆蓋的細胞核),只計數核上的銀粒數目,再扣除本底,結果以銀粒數/核的均值或含10個銀粒左右細胞的百分率表示。


    液閃計數法:
    1.細胞培養和處理:人二倍體成纖維細胞:接種在培養皿中培養。
    2.加培養液、MNNG、羥基脲,以及3H-TdR處理等于前5項相同。自(5)漂洗后。
    3.消化:用0.25%胰蛋白酶消化,制成懸液。
    4.液閃計數標本制備:10%三氯醋酸處理,將細胞收集在玻璃纖維濾紙片上,無水乙醇脫水烤干,置液閃杯中,加閃爍液,置液閃計數儀上計數。結果以dpm/106細胞或cpm/每皿細胞表示。

     
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