1‌、降低冰點與抑制冰晶形成（冷凍保護）：‌

純水在0℃結冰，形成的尖銳冰晶會像刀子一樣‌刺穿‌微生物的細胞膜、細胞壁和內部結構（如細胞器、DNA），導致細胞死亡。

甘油是一種‌多羥基醇‌，溶于水后能與水分子通過氫鍵強烈結合。這干擾了水分子形成規則冰晶網絡的能力。

‌降低冰點：‌ 甘油溶液比純水在更低的溫度才會開始結冰。

‌減小冰晶尺寸，抑制冰晶生長：‌ 在冷凍過程中（無論是慢速冷凍還是快速冷凍），甘油的存在顯著‌減小了形成的冰晶尺寸‌，并使冰晶的結構變得‌更圓滑、更小、更少‌。這大大降低了尖銳冰晶對細胞造成的物理損傷（機械損傷）。

‌促進玻璃化（Vitrification）：‌ 在極低溫度下（如-80℃或液氮溫度-196℃），高濃度的甘油溶液傾向于形成一種‌玻璃態或非晶態固體‌，而非尖銳的晶體結構。這種玻璃態就像極其粘稠的糖漿凍住了，沒有明顯的晶體邊界，從而最大限度地消除了冰晶損傷。

‌2、滲透壓緩沖（滲透保護）：‌

在冷凍過程中，細胞外的水分會首先凍結，導致細胞外溶液的‌溶質濃度急劇升高（溶液變濃）‌，形成極高的‌滲透壓‌。

如果沒有保護劑，細胞內水分會因滲透壓差被大量抽出（細胞脫水），導致細胞嚴重皺縮甚至死亡。復溫時，外部冰融化導致滲透壓驟降，水分又會快速涌入細胞，可能導致細胞膜破裂（滲透性休克）。

甘油是‌可滲透性保護劑（Cryoprotectant Permeant - CPA）‌，這意味著它能夠緩慢地‌穿過大多數微生物的細胞膜‌進入細胞內部。

‌平衡滲透壓：‌ 當甘油進入細胞后，它在細胞內外都提高了溶液的濃度（降低了水活度）。在冷凍過程中，它有助于平衡細胞內外環境的滲透壓，顯著‌減少了細胞脫水的程度和速度‌。這使得細胞在冷凍/解凍過程中體積變化更緩和，減輕了滲透壓變化帶來的壓力。

3‌、穩定生物大分子與細胞膜：‌

‌氫鍵作用與水合作用：‌ 甘油分子上的羥基可以與蛋白質、核酸、磷脂等生物大分子上的基團（如氨基、羧基、磷酸基）形成氫鍵。這種相互作用有助于在冷凍脫水期間或低溫狀態下，‌穩定這些大分子的三維結構‌，防止其變性、沉淀或聚集。

‌維持膜流動性：‌ 甘油被認為可以插入細胞膜的脂質雙分子層中，有助于在低溫下‌維持細胞膜一定的流動性‌或防止其發生有害的相變（如從液晶態轉變為凝膠態），從而保持膜結構的完整性。

4‌、降低水活度：‌

甘油本身具有吸濕性，其大量羥基結合水分子，‌降低了溶液中的“自由水”含量‌，即降低了水活度。較低的水活度本身就不利于許多生化反應和微生物活動（即使在未凍結狀態下），這有助于在冷凍前和部分解凍狀態下保持菌種的穩定性。

‌總結來說，甘油在微生物冷凍保存中的作用是多方面協同的：‌

‌物理保護：‌ 抑制有害冰晶的形成和生長，減少冷凍/解凍過程中的‌機械損傷‌。

‌滲透保護：‌ 作為滲透性保護劑，緩沖細胞內外滲透壓的劇烈變化，減輕‌脫水損傷‌和‌滲透性休克‌。

‌生化保護：‌ 通過氫鍵等作用穩定蛋白質、核酸和膜結構，防止‌低溫變性和損傷‌。

‌降低水活度：‌ 創造不利于微生物活動的微環境。

‌關鍵操作要點：‌

‌濃度：‌ 通常使用 ‌15-30% (v/v)‌ 的終濃度（常見20%-25%）。濃度過低保護不足；濃度過高可能因滲透壓過高或甘油本身的毒性導致細胞損傷。不同微生物對甘油的耐受性不同，需要優化。

‌純度與無菌：‌ 必須使用‌高純度（如分析純或細胞培養級）的無菌甘油‌。甘油通常通過高壓蒸汽滅菌（121°C, 15-20分鐘），注意甘油高溫下易變黃但不影響保護效果，關鍵是滅菌徹底。也可用0.22 μm濾膜過濾除菌。

‌制備：‌ 通常與菌懸液（處于對數生長期，濃度較高）等體積混合，以達到最終所需的甘油濃度。確保甘油與菌液混合均勻。

‌冷凍速度：‌ 通常推薦‌緩慢冷凍‌（如使用程序降溫盒或置于-70℃至-80℃冰箱過夜后再轉移至液氮），讓甘油有足夠時間滲透入細胞并發揮保護作用。對于某些耐受性強的微生物，直接投入液氮氣相或-80℃冰箱也可行。

‌儲存溫度：‌ ‌-80℃冰箱或液氮（-196℃）‌ 是最常用的長期保存溫度。

‌避免反復凍融：‌ 解凍后應盡快使用，避免多次凍融循環，每次凍融都會造成損傷累積。

‌與其他保護劑的比較：‌

‌DMSO（二甲基亞砜）：‌ 也是常用的滲透性冷凍保護劑，保護機理類似甘油。滲透速度通常比甘油快，對某些微生物效果更好，但對某些細胞類型毒性更大或有特殊氣味。

‌脫脂牛奶/海藻糖（凍干保護劑）：‌ 主要用于冷凍干燥保存（凍干法）。它們是‌非滲透性保護劑‌，主要通過在細胞外層形成保護性基質、替代水分子穩定大分子結構等方式保護細胞。

‌甘油的優勢：‌ 相對安全（低毒），價格低廉，操作簡便，對大多數細菌、酵母、絲狀真菌都有良好效果，因此在微生物實驗室冷凍保存中應用最為廣泛。

總而言之，甘油通過其獨特的物理化學性質（多羥基、滲透性、與水分子強相互作用），在微生物冷凍保存中起到了多重保護作用，有效防止了冰晶損傷、滲透壓損傷和低溫變性，使得微生物能夠在超低溫下長期存活。